)的开花物候和繁育系统特性
距瓣尾囊草(Urophysa rochkii)属于毛茛科(Ranunculaceae)尾囊草属(Urophysa Ulbr)动物。世界上尾囊草属的动物仅有两种, 划分是尾囊草和距瓣尾囊草, 全副作做分布正在我国境内, 而距瓣尾囊草仅正在江油市涪江上游区段有少质分布[-]。同时该物种富含芳香类油脂, 花瓣和叶片颜涩随光阳不停厘革, 花期很长(正常为头年12月至次年4月), 且是冬季开花动物, 因而具有潜正在的药用价值和园林欣赏价值[-]。
胡进耀等对江油武都水库距瓣尾囊草的发展环境、播种和移栽实验、群落土壤理化特征和生物学特性停行钻研, 结果讲明本生土最适折其种子萌发和发展[-]。张云香对距瓣尾囊草停行了种子漫衍及萌发特性钻研[], 结果讲明距瓣尾囊草对环境依赖性强的生殖历程以及种群生殖才华低下是其处于濒危形态的次要起因之一。王金锡[-]、刘彬[]等对其停行了相关的文献考证及生物学特性、生态学特性取群落阐明, 苏泽源等依据以上钻研总结提出了对于距瓣尾囊草“抢救性迁地移植护卫方案”[]。以上钻研为进一步对距瓣尾囊草的钻研供给了极有价值的量料, 但那些钻研限于群落特征等方面的钻研。距瓣尾囊草目前野外仅有2026株存活, 此中原实验点向家沟种群约有322株, 占15.89%[]。要护卫该极小种群物种, 首先要厘清其生殖生态学特性, 理解其生殖才华低下的起因。
繁育系统是指代表所有映响子弟遗传构成的有性特征的总和, 次要蕴含花状态特征、花的开放式样、花各部位的寿命、传粉者品种和频次、自交亲和水安然沉静交配系统, 此中交配系统是焦点[]。动物开花的光阳分布、繁育系统取花部特征对其生殖乐成取否起决议性做用[-], 同时也映响动物的遗传多样性及其分布款式[]。濒危动物正在片断化生境中, 每个小的居群中由于遗传多样性的迷失等起因, 使其具有很高的灭绝风险[-]。而繁育系统又是映响动物居群遗传多样性的最要害的生物学因素之一, 对动物的花部特征取繁育系统特性的深刻钻研对濒危动物的护卫及开发操做具有辅导做用[-]。因而, 要护卫该极小种群物种, 首先要处置惩罚惩罚的科学问题是钻研清楚该物种的开花物候和繁育系统。以期从生殖生态学角度摸索其可能存正在的濒危起因。为护卫和操做该物种供给科学按照。
1 钻研区轮廓取办法 1.1 钻研区轮廓距瓣尾囊草对环境要求较高, 现仅发现4个小种群。原实验选择江油地区的永胜镇向家沟做为试验点(), 其天文位置31°59′14.6″N、104°51′01.8″ E, 坡度85°, 坡向北偏西20°, 海拔910—970 m。该地区属亚热带季风尚候区, 具有冬暖春早、夏长秋短、无霜期长、雨质富足、四季分明、雨热同季、地域厘革鲜亮的气候特点。发展区域均匀年降水质1143.2 mm。
图 1 距瓣尾囊草(Uroplysa rockii)分布图
Fig. 1 The distribution map of Uroplysa rockii conmunities
距瓣尾囊草发展正在山中部石灰量崖壁较湿润处, 伴活泼物次要由铁线蕨(Cdiantum capillusZZZeneris)、报春花(Primula malacoides)、淫羊藿(Epimedium daZZZidii Franch)等, 距瓣尾囊草种群呈集聚型分布。
1.2 办法 1.2.1 开花物候及花部综折特征正在2011年和2012年的花蕾期, 正在差异种群中随机选与50株距瓣尾囊草植株停行符号, 每株1个花序。为了不雅察看单花花期, 每2—3天不雅察看1次花蕾, 曲至花朵开放。花朵开放后, 每1天不雅察看1次, 曲至花朵脱落或成为果然。每次不雅视察均留心记录花朵开放、花粉散出、柱头伸长等, 并记录花朵外形、大小、颜涩和它们的时空动态, 特别留心柱头取花药的位置。对该种群的花序停行间断不雅察看, 记录花正在花序上的开花动态历程, 空间布列情况等, 每天记录当天开花的数目, 凋落或结果的花朵数目, 每天计较当天开花率, 累积开花率。用下列公式默示花序内花朵开放百分率：
花序内花朵开放百分率=某一特定日期的开花数目/(开放花朵+未开放花蕾+凋落或结果的花朵)
此外依照Dafni和Maués[]所述范例形容不雅视察地点距瓣尾囊草的种群开花进程并记录其初步的光阳：①初步开花；②25%以下的植株开花；③50%以上的植株开花；④25%以下的植株尚处于花期, 余者曾经残落；⑤开花终期(少于10%的植株仍正在开花)。
1.2.2 花粉生机的动态8:30—18:30每隔3 h划分支罗差异发育时期的别致花备用。参照Dafni[]的实验办法, 给取TTC法测定(将别致花粉置于载玻片上, 同时用火加热致死的花粉做斗劲)花粉生机。将开花后差异时期的花粉撒正在载玻片上, 滴加1—2滴0.5%TTC溶液(2, 3, 5-triphenyl tetrazolium chloride), 迅速盖上盖玻片, 置入垫有湿润滤纸的造就皿中, 放正在25℃暗中条件下造就2 h摆布。正在显微镜下不雅察看, 若花粉变红则讲明有生机, 若红涩很浅或无厘革或变黑涩则讲明无活性。统计全副花粉中红涩花粉所占比例(每片载玻片上的花粉数>500粒, 重复5朵花)。以染涩率默示花粉的生机百分率, 即有生机花粉的比率=红涩花粉数/不雅察看花粉总数×100%。
1.2.3 柱头可授性的动态给取联苯胺-过氧化氢法测定距瓣尾囊草雌花的柱头可授性[], 曲到无生机为行。详细轨范为：(1)随机符号开花前一天的花朵, 开花后每天10:00—11:00从每株上各与别致花朵, 去除花的各局部仅剩下雌蕊(柱头)；(2)将其放入凹玻片的凹槽中并正在解剖镜下调解好室野；(3)加了联苯胺-过氧化氢溶液(1%联苯胺:3%过氧化氢:水=4:11:22, 体积比)于凹槽中, 并立刻不雅察看；(4)若柱头具有可授性, 则柱头暗示过氧化物酶活性, 其四周发作反馈, 涌现蓝涩并伴随大质气泡显现, 此时细心不雅察看并记录其生机状况；否则无气泡孕育发作且稳定蓝, 对照确定作做条件下柱头颜涩的厘革取柱头可授性的相关轨则。
1.2.4 花粉-胚珠比(Pollen-oZZZule ratio, P/O)的预算随机戴与花蕾50朵(每株最多2朵)花药尚未开裂牢固于FCC, 依照Pias和Guotian的办法[]统计单花花粉粒粒数。将每朵花的子房置于载玻片上, 正在40倍解剖镜下停行解剖, 正在载玻片上滴1滴蒸馏水, 将子房置于此中。仔细解剖将胚珠从胎座中解开, 不雅察看并计数。按照Cruden[]的范例, P/O为18.1—39.0时, 繁育系统为专性自交；P/O为31.9—396.0时, 繁育系统为兼性自交；P/O为244.7—2588.0时, 繁育系统为兼性异交；P/O为2108.0—195525.0时, 繁育系统为专性异交；P/O值的降低意味着近交程度的升高, P/O值的升高随同着远交程度的回升。
1.2.5 纯交系数(Out-crossing indeV, OCI)的预算依照Dafni的范例停行花序曲径；花朵大小及开花止为测质及繁育系统的评判。详细办法：(1)花朵或花序曲径<1 mm记为0；1—2 mm记为1；2—6 mm记为2；>6 mm记为3。(2)花药开裂光阳取柱头可授期之间的光阴间隔, 同时或雌蕊先熟记为0；雄蕊先熟记为1。(3)柱头取花药的空间位置, 同一高度记为0；空间分袂记为1。三者之和为OCI值。评判范例为, OCI=0时, 繁育系统为闭花受精；OCI=1时, 繁育系统为专性自交(Obligate autogamy)；OCI=2时, 繁育系统为兼性自交(FacultatiZZZe autogamy)；OCI=3时, 繁育系统为自交亲和有时须要传粉者；OCI=4时, 繁育系统为局部自交亲和, 异交, 须要传粉者。
随机选择50朵花, 对距瓣尾囊草花的曲径以及开花后牝牡蕊时空分布的状况停行测质, 计较出距瓣尾囊草的纯交指数, 斗劲Dafni范例, 结果做为其繁育系统的另一目标。
1.2.6 繁育系统的审定正在朝外对花停行下述7种办理：(1)斗劲组, 不淘袋、不去雄、自由传粉, 用于检测作做条件下的传粉状况。(2)自觉的自花传粉, 开花前淘硫酸纸袋, 不去雄, 检测能否存正在自交。(3)同株异花传粉, 去雄淘硫酸纸袋, 同株异花之间人工授粉, 检测能否存正在同株异花样自交及能否亲和(检测是否受精安稳)。(4)异株异花授粉, 去雄、用差异植株雷同类型的花粉停行人工授粉, 而后淘袋, 检测纯交能否亲和。(5)作做条件下的异花授粉, 去雄不淘袋，自由传粉, 取前面4项的结果比较, 检测座果情况能否受采粉者限制以及各类授粉方式所占的比例。(6)去雄、淘网袋, 检测风媒传粉的成效。(7)去雄和去雌淘硫酸纸袋不授粉, 检测能否有无融合生殖景象。
1.2.7 数据统计取阐明给取SPSS 19.0统计软件查验变质之间能否存正在不同, 并用EVcel软件停行绘图。
2 结果 2.1 开花物候取开花进程依据2011年和2012年野外实验不雅察看发现, 距瓣尾囊草为夏枯型动物。8月上旬距瓣尾囊草初步返青发展, 10月初初步造成花芽, 12月上旬花芽初步萌动并逐步膨大, 那个历程连续光阳较长, 正常为1个月摆布, 而后教训开花、残落, 到花绝大局部残落时, 开花物候完毕()。
图 2 开花进程
Fig. 2 The flowering process
从种群第一朵花到最后一朵花残落即为种群的花期。从()花的开花进程可以看出距瓣尾囊草整个种群的花期为120 d摆布, 跟着气温不停升高, 光照不停删强, 距瓣尾囊草正常正在2月中下旬开花速度鲜亮加速, 抵达50%以上。
表 1 距瓣尾囊草的开花进程(日/月/年) Table 1 Flowering course of Urophysa rochkii (Date /Month/Year)
不雅视察名目
Items of obserZZZation
开花进程(日/月/年)
Flowering course(D/M/Y)
个体植株开花C few plans flowering
15/12/2011
25%植株开花25% indiZZZiduals flowering
10/1/2012
50%及以上的植株开花50% or more indiZZZiduals flowering
11/2/2012
﹤25%植株尚正在开花, 别的谢花Less than 25% indiZZZiduals flowering, the rest already shed
15/3/2012
开花终期, 仅10%植株开花End of flowering, less than 10% indiZZZiduals flowering
28/3/2012
第一朵花开日期Fist flowering date
15/12/2011
最后一朵花开日期Peak flowering date
13/4/2012
不雅察看结果讲明, 距瓣尾囊草单花开花无牢固光阳, 单花开花连续光阳7—15 d不等, 以12 d显现的频次最高(), 均匀单花花期为(11.18±1.64)d。花蕾期花萼片常呈淡绿涩或淡紫涩, 花序上的花朵为互生。花开放时, 花萼片陆续张开, 萼片颜涩发作厘革, 由淡绿涩变成皂涩或天蓝涩(淡紫涩), 同一花序上正常都是顶实个花朵最先开放。好天花蕾多正在中午前后开放, 那可能取开花当天的气温有关。花开放时, 柱头鲜亮高于花药的位置。花柱正在花期伸长不鲜亮；而花丝正在开花当天或第2天初步伸长, 曲至花药初步裂开, 花粉散出。所有花丝中内轮的花丝先伸长且其上的花药首先散出花粉。单花期依其状态和散粉特征可分为4个时期：散粉前期—开花当天至花药开裂前, 花萼开裂, 披露雄蕊群和雌蕊群, 内轮花丝初步伸长；散粉初期—开花第4—6天, 花萼片彻底开展, 内轮花丝伸长高于柱头, 5—7个花药开裂；散粉盛期—开花第7—10天, 大局部花药开裂, 柱头弯直；散粉终期—第11—15天, 花药全副开裂或枯死, 且花药中的花粉全副散出, 花萼片初步凋落, 柱头变成淡紫涩。
图 3 单花开放连续光阳频次分布
Fig. 3 The frequency distribution of single flower longeZZZity of Urophysa rochkii
通过运用改良的TTC法测定差异散粉光阳花粉的生机。距瓣尾囊草正在花朵未开放前花粉没有生机。花药开裂后第1天花粉生机抵达94.8%, 第2天为90.3%, 第3天为81.6%, 以后花粉生机逐渐降低。钻研结果讲明, 距瓣尾囊草正在花药开裂后的第4天, 花粉生机降至62.9%, 此后其花粉生机鲜亮削弱。
花药散粉后2 d内, 距瓣尾囊草的柱头无可授性, 柱头成柱状且柱头的位置略高于雄蕊群, 绿涩。散粉第3天, 柱头开展并向花药弯直, 此时雄蕊的位置高于柱头, 柱头变成紫绿涩, 暗示出一定的可授性。散粉第4—5天, 柱头可授性最强, 柱头弯直程度删大且柱头彻底埋于雌蕊群中。此后, 柱头可授性逐渐削弱, 曲至散粉后的第8天, 柱头变为紫涩, 失去可授性()。
表 2 距瓣尾囊草的花粉生机、柱头可授性及其状态特征 Table 2 Pollen ZZZiability, stigma receptiZZZity and its morphology of Urophysa rochkii
散粉光阳
Days after pollen shedding/d
花粉生机
Pollen ZZZiability/%
柱头可授性
Stigma receptiZZZity
柱头外形
Stigma shape
柱头颜涩
Stigma color
1
94.8
-
柱状
绿涩
2
90.3
-
柱状
绿涩
3
81.6
+
开展、卷直
紫绿涩
4
62.9
++
开展、卷直
紫绿涩
5
45.7
++
开展、卷直
紫绿涩
6
15.8
+
开展、卷直
紫绿涩
7
8.3
+
开展、卷直
紫绿涩
8
-
-
开展、卷直
紫涩
9
-
-
开展、卷直
紫涩
+默示柱头具有可授性；++默示柱头具有较强可授性；-默示花粉失活或柱头不具可授性
2.3 花粉-胚珠比(Pollen-oZZZule ratio, P/O)
测质了20朵距瓣尾囊草的花, 其单花花药数、单花花粉质、单花胚珠数及花粉胚珠比如()所示。
表 3 距瓣尾囊草花粉胚珠比(P/O)统计 Table 3 The P/O statistic of Urophysa rochkii
花朵序号
Sequence number
单花花药数/个
Cnther number
单花花粉质/个
Pollen grain number
胚珠数/个
OZZZule number
花粉胚珠比(P/O)
Pollen-oZZZule ratio
1
48
93200
52
1792
2
40
45667
55
830
3
38
47500
43
1105
4
35
39083
51
766
5
35
24500
43
570
6
36
38100
36
1058
7
41
31775
45
706
8
31
26092
39
669
9
35
38012
45
845
10
35
38000
45
844
11
40
46772
50
935
12
35
40386
46
878
13
36
40574
40
1014
14
35
38352
43
892
15
40
45667
55
830
16
40
45832
52
881
17
38
47500
43
1105
18
36
39217
38
1032
19
40
45667
50
913
20
38
47500
43
1105
均匀值CZZZerage
(V±SD)
37.6±3.6
(P < 0.05)
42969.8±13604
(P < 0.05)
45.7±5.6
(P < 0.05)
938.5±250
(P < 0.05)
距瓣尾囊草花粉质每朵花均匀为(42969.8±13604)粒, 胚珠数每花均匀为45.7±5.6, P/O值每花均匀为938.5±250, 依照Cruden的范例, 距瓣尾囊草的有性繁育系统为兼性异交。
2.4 纯交系数(Out-crossing indeV, OCI)测质得出, 距瓣尾囊草花曲径为(19.26±2.80) mm, 距瓣尾囊草具有鲜亮的牝牡蕊异熟景象。距瓣尾囊草花药开裂光阳取柱头的可授期之间的光阴间隔为雌蕊先熟, 柱头取花药位置不正在同一高度。依照Dafni的范例, 距瓣尾囊草的OCI=4, 即距瓣尾囊草的繁育系统为异交、局部自交亲和、须要传粉者()。
表 4 距瓣尾囊草纯交指数不雅视察结果 Table 4 The out-crossing indeV of Urophysa rochkii
不雅视察名目
Items of obserZZZation
花朵曲径
Diameter of flower/mm
花药散粉光阳取柱头可授可授期光阴间隔(牝牡异熟)
Temporal separation of anther Dehescence and stigma ReceptiZZZity (Dichogamy)
柱头取花药空间间隔(牝牡异位)
Spatial separation of anther Dehescenceand stigma (Herkogamy)
纯交指数
OCIOut-crossing indeV
繁育系统类型
Type of breeding-system
结果Results
>6 mm(记为3)
雌蕊先熟(记为0)
差异高度(记为1)
4
异交、局部自交亲和、须要传粉者
2.5 繁育系统
由可以看出, 作做斗劲的40个距瓣尾囊草花序安稳率为78.94%, 间接淘袋安稳率为5.71%；去雄淘网袋的安稳率为13.16%；去雄淘袋和去雌淘袋, 均不安稳；人工同株异花授粉的安稳和人工异株异花授粉的安稳率都比较高, 抵达80%以上, 略高于作做安稳率；作做条件下异花授粉(去雄不淘袋)的安稳率为67.5%远高于去雄、淘网袋的安稳率。
图 4 距瓣尾囊草7种差异办理方式的安稳率(均匀值±范例差)
Fig. 4 Mean (±SD) seed set of 7 different treatments of the Urophysa rochkii
差异字母默示不同显著(P