腺病毒包装
重组腺病毒载体是基于人腺病毒 5 型（Ad5），其基因组是 36kb 长的线性双链 DNA，是一种复制缺陷型腺病毒载体系统。具有以下几多个显著劣点：传染领域广，的确可以传染所有的细胞系、本代细胞和局部组织；传染效率可高达 100%；对外源基因容载才华大（可以高达 8Kb）；不整折基因组；滴度高，收配便捷。因而，重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。
最罕用的腺病毒包拆体系有 AdEasy 和 AdMAX 两种，其怪异特点是宗旨基因首先克隆到穿越载体，再重组到腺病毒的大骨架上。以上两个系统均具有腺病毒晚期转录复制基因 E1 和 E3 的缺陷（ΔE1，ΔE3），此中 E3 基因对病毒的孕育发作并非必需。因而，腺病毒包拆必需依赖表达 E1 的细胞系，譬喻 HEK-293，HEK-293A 等。
本理
整体包拆流程
图 1、 腺病毒包拆实验流程图
资料取仪器
表 1、腺病毒包拆系统量粒
轨范
量粒构建和扩删
AdMAX 系统：构建连贯宗旨基因的 pHBAdMAX量粒和pBHGloV(delta)E1, 3Cre 量粒并大质抽提，用于转染 293A 细胞。
AdEasy 系统：构建连贯宗旨基因的 pHBAdEasy 量粒并停行酶切线性化；线性化后转入 BJ5183 感应态（含 pAdEasy-1 骨架量粒）停行重组，涂板造就单克隆并扩删，抽提量粒停行 PacI 酶切验证；验证准确的重组量粒转化 Stbl3 感应态，获得高杂度的重组量粒并停行 PacI 酶切线性化，用于转染 293A 细胞。
腺病毒包拆
表 2、腺病毒包拆转染体系
腺病毒聚集挑与 3-6 个空斑不等，放入1 ml别致造就基中留宿，而后比较滴度，运用滴度最高的一个空斑停行后续实验。（注：病毒聚集前要不雅察看病毒空斑能否造成。为了限制病毒的扩散而让空斑更好地造成，可正在造就液中参预低熔点琼脂糖，正常正在转染后第 10 ~ 21 天可以正在显微镜下看到小的空斑。）
腺病毒扩删将造就基中的病毒参预别致 293A 细胞造就液中停行病毒少质扩删，至再次显现空斑，聚集细胞及上清，反复冻融三次聚集病毒（P1 代），传染 293A 细胞，间断停行三代传染，至 P4 代停行腺病毒的大质扩删并聚集病毒。
腺病毒杂化将病毒从 -80 ℃ 冰箱与出，室温水浴融化。正在 4 ℃ 下，7000 g 离心 10 min，弃细胞碎片，聚集上清，0.22 μm 过滤除菌便可用于细胞实验。若用于对腺病毒滴度和杂度要求高的植物实验，则须要给取 PEG8000 沉淀-CsCl 密度梯度离心-透析联用法停行杂化。
病毒重悬和保存弃上清，500 μl 重悬液重悬病毒沉淀，一周内运用则置于 4 ℃ 保存，如需长光阳寄存需置于 -80 ℃ 或液氮罐保存。
留心事项
腺病毒相关实验请正在生物安宁柜（BL-2 级别）内收配。
收配病毒时请穿实验服，佩摘口罩和手淘，尽质不要暴露双手及手臂的皮肤。
收配病毒时出格小心病毒溅出。假如收配时超脏工做台有病毒污染，请立刻用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干脏。接触过病毒的枪头、离心管、造就板、造就液请用84消毒液浸泡后统一办理。
如须要离心，应运用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。
植物打针收配请正在生物安宁柜内（BL-2 级别）完成。
病毒相关的废除物须要非凡聚集，统一经高温灭菌办理。
实验完结用洗手液荡涤双手。
常见问题
1、腺病毒载体有几多代，须要怎么选择？
第一代腺病毒载体：E1/E3 基因缺失的腺病毒载体称为第一代腺病毒载体；
第二代腺病毒载体：E2A/E4 基因缺失的腺病毒载体被称为第二代腺病毒载体，孕育发作的免疫本性较低，载体容质和安宁性方面均进步，但病毒包拆难度和出毒滴度重大下降，使用受限。
第三代腺病毒载体：第三代载体缺失了全副的或大局部腺病毒基因，仅糊口生涯了两端 ITR 和包拆信号。包拆容质高达 35kb，免疫本性极低，载体中引入核基量附着区基因用于外源基因历久表达并删多了载体的不乱性。但第三代载体系统须要腺病毒渐变体做为帮助病毒。
目前，第一代腺病毒载体仍是科研和临床使用最为宽泛的腺病毒载体，因而更为引荐。
2、腺病毒的两种包拆系统怎样选择？须要依据原人实验室的经历以及需求停行选择。
AdEasy 系统：收配轨范相对可控，AdEasy 系统获得的病毒滴度相对较高。AdEasy 系统是较罕用的系统，正在 BJ5183 感应态中完成环状腺病毒基因组的重组，将重组腺病毒基因组经 Pac I 酶切线性化后转染 293A 细胞。但重组腺病毒基因组的阳性率比较低，须要筛选大质的克隆停行验证。
AdMaV 系统：是间接将穿越量粒和骨架量粒导入到包拆细胞 293A 中，重组历程不成控，中间无奈停行挑选，所以重组假阳性较高，挑选阳性结果的难度较 AdEasy 系统高不少。 但 AdMaV 包拆系统流程更烦琐易收配，符折新手钻研人员。
3、腺病毒杂化的宗旨是什么？杂化后的腺病毒可以去除缺损的病毒颗粒、细胞毒素、细胞造就基、以及细胞碎片等纯量。杂化腺病毒免疫本性较低，更符协作植物实验。
4、腺病毒传染毒斑和细胞搜集怎样停行区分？镜下不雅察看发现类似病毒空斑大概细胞搜集的景象时，应继续造就 1-3 天，不雅察看搜集区域能否扩散，若连续扩散正常为病毒毒斑，若搜集区域保持稳定，则正常为细胞搜集景象。